В.В. Скворцов, д.м.н., доцент; А.В. Тумаренко, к.м.н.; Е.М. Скворцова, Волгоградский государственный медицинский университет
Современные проблемы клинической и лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции Клиническая диагностика
Ранняя диагностика обеспечивает своевременное проведение диспансеризации, психологической помощи, социальной реабилитации, позволяет продлить жизнь больным и даже надеяться на излечение.
Сложность ранней диагностики, базирующейся на клинической картине, заключается в неспецифичности, полиморфности симптоматики на стадии II, отсутствии клиники в стадии I. Тем не менее, во всех случаях немотивированной утомляемости, наличия ночных потов, головной боли, особенно на фоне кратковременной лихорадки (3-10 дней) с температурой тела 38-38,5*С, сопровождающейся тонзиллитом; длительного диарейного синдрома, похудания за короткое время, необходимо в первую очередь исключить ВИЧ-инфекцию.
Постановке диагноза в этот период помогает выявление при объективном обследовании разнообразной кожной сыпи (пятна, папулы, розеолы, гнойнички) или фурункулеза. Наличие лимфаденопатии (даже в случаях увеличения одной группы лимфатических узлов) уже с большей долей вероятности позволяет заподозрить ВИЧ-инфекцию. Для болезни особенно характерно увеличение заднешейных, подчелюстных, над- и подключичных, подмышечных и локтевых лимфатических узлов. Как правило, они увеличиваются до 2-5 см в диаметре, безболезненны, плотноэластичной консистенции, могут сливаться в конгломерат. Весьма характерно для ВИЧ-инфекции увеличение более чем одного узла, более чем одной группы (за исключением паховых), длящееся более 3 мес.
Нередко в ранней фазе болезни имеется психоневрологическая симптоматика: чувство тревоги, депрессия, шаткость походки, снижение остроты зрения, судорожные припадки с признаками поражения психоэмоциональной сферы (нарушение памяти, забывчивость, неадекватность поведения, притупление эмоций).
Клиническая диагностика ВИЧ-инфекции - это, прежде всего, диагностика спектра СПИД-ассоциированной патологии у больного вторичным иммунодефицитом.
СПИД-индикаторные заболевания
Заболевания 1 группы
1. Кандидоз пищевода, бронхов или легких.
2. Внелегочный криптококкоз (европейский бластомикоз).
3. Криптоспородиоз с диареей, продолжающейся более 1 мес.
4. Цитомегаловирусные поражения каких-либо органов (за исключением печени, селезенки и лимфатических узлов) у больного старше 1 мес.
5. Инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса с язвенным поражением на коже и/или слизистых оболочках, которые персистируют дольше 1 мес; герпетические бронхиты, пневмонии, или эзофагиты любой продолжительности у больного старше 1 мес.
6. Саркома Капоши у больного моложе 60 лет.
7. Лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет.
8. Лимфоцитарная интерстициальная пневмония и/или легочная лимфоидная гиперплазия у детей в возрасте до 14 лет.
9. Диссеминированная инфекция, вызванная бактериями группы Mycobaсterium avium intercellulare или М. kansassii с поражением различных органов (за исключением или помимо легких, кожи, шейных или прикорневых лимфатических узлов).
10. Пневмоцистная пневмония.
11. Прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия.
12. Токсоплазмоз ЦНС у больных старше 1 мес.
Заболевания II группы
1. Бактериальные инфекции, сочетанные или рецидивирующие у детей до 14 лет (более 2 случаев за 2 г. наблюдения): септицемия, пневмония, менингит, поражения костей и суставов
2. Кандидамикоз диссеминированный (внелегочная локализация)
3. ВИЧ-энцефалопатия («ВИЧ-деменция», «СПИД-деменция»).
4. Гистоплазмоз диссеминированный с внелегочной локализацией.
5. Изоспороз с диареей, персистирующий более 1 мес.
6. Саркома Капоши у людей старше 60 лет.
7. Лимфома головного мозга (первичная) у людей старше 60 лет.
8. Другие В-клеточные лимфомы (за исключением болезни Ходжкина) или лимфомы неизвестного иммунофенотипа.
9. Микобактериоз диссеминированный (не туберкулез) с поражением, помимо легких, кожи, шейных или прикорневых лимфатических узлов.
10. Туберкулез внелегочный (с поражением органов помимо легких).
11. Сальмонеллезная септицемия рецидивирующая, обусловленная не S. typhi.
12. ВИЧ-дистрофия (истощение, резкое похудание).
1 группа - для постановки диагноза ВИЧ-инфекции не требуется лабораторное подтверждение.
2 группа - для постановки диагноза требуется лабораторное подтверждение.
Постановка диагноза ВИЧ правомерна в случаях, если: а) у инфицированного имеется одно из 23 СПИД-ассоциированных состояний или б) он ВИЧ-инфицирован и имеет менее 200 СД4-клеток/мл.
Поскольку ВИЧ-индикаторные заболевания включают 23 нозологические формы, наиболее целесообразен синдромальный подход к диагностике.
Первым проявлением ВИЧ-инфекции обычно бывает непродолжительная лихорадка, которая проходит без лечения (острая лихорадочная фаза). Вслед за этим наступает длительный период, для которого характерно отсутствие каких-либо клинических проявлений и постепенное развитие иммунодефицита (бессимптомная фаза). У многих ВИЧ-инфицированных бессимптомная фаза длится 5-10 лет. Длительное наблюдение за ВИЧ-инфицированными показало, что в 70% случаев СПИД развивается через 10 лет после инфицирования. У 30% больных заболевание развивается более медленно, причины этого неизвестны. По некоторым данным, более медленное прогрессирование ВИЧ-инфекции обусловлено активностью цитотоксических T-лимфоцитов (CD8), направленных против инфицированных клеток.
Согласно критериям Центра по контролю заболеваемости США, диагноз СПИДа ставится, если содержание лимфоцитов CD4 в крови ниже 200 мкл-1. Оппортунистические инфекции (вирусные, грибковые, протозойные) и такие злокачественные новообразования, как саркома Капоши и B-клеточные лимфомы, также подтверждают диагноз СПИДа. Вскоре после заражения, в течение острой лихорадочной фазы, ВИЧ обнаруживается в крови. Через несколько недель виремия проходит, и в крови повышается число цитотоксических T-лимфоцитов (CD8). Хотя после исчезновения вируса из крови в ней появляются нейтрализующие антитела, считается, что они не играют роли в исчезновении виремии. Покидая кровь, вирус оседает в лимфоидных органах, где происходит его репликация. В течение бессимптомной фазы число лимфоцитов CD4 в крови каждый год снижается на 50-100 мкл-1.
При оппортунистических инфекциях наблюдается более интенсивное снижение числа лимфоцитов CD4. Скорость прогрессирования заболевания в разных группах риска (например, у инъекционных наркоманов, реципиентов крови) одинакова. В конце бессимптомной фазы вирус выходит из лимфоидных органов. По мере прогрессирования заболевания в крови возрастает содержание бета2-микроглобулина, неоптерина, триглицеридов и антигенов ВИЧ (в частности, p24). Эти показатели позволяют оценить тяжесть заболевания и прогноз. Стадию заболевания обычно определяют по абсолютному числу лимфоцитов CD4 и уровню бета2-микроглобулина в крови. Такие симптомы, как лихорадка, потливость и похудание, свидетельствуют о резком угнетении иммунитета и неблагоприятном прогнозе.
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции базируется на трех направлениях:
а) индикация ВИЧ и его компонентов;
б) выявление анти-ВИЧ;
в) определение изменений в иммунной системе.
Среди существующих методов лабораторной диагностики наиболее распространены серологические - выявление антител к антигенам вируса.
Для выявления антител в основном используют иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ). В первом случае выявляют суммарные антитела к белкам ВИЧ, во втором — к отдельным белкам. В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, на которые сорбируются антитела больного, а комплекс антиген-антитело выявляется с помощью конъюгата антивидового иммуноглобулина с ферментом. Метод довольно специфичен (99 %) и достаточно чувствителен (93-99 %), позволяет выявлять вирусспецифические антитела у 95% инфицированных. Отрицательные 5% случаев приходятся на ранние этапы инфицирования, когда антител в сыворотке крови еще мало, или на терминальные фазы болезни, когда организм уже не в состоянии синтезировать антитела из-за истощения иммунной системы.
Кроме того, при инфекционном процессе наблюдаются периоды исчезновения антител из крови, что также приводит к отрицательным результатам ИФА. Возможны ложноположительные данные ИФА, как правило, у больных с аутоиммунными заболеваниями, при инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр, когда происходит перекрестная реакция антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейн-Барр или к молекулам главного комплекса гистосовместимости. Подобные ложноположительные реакции встречаются в 0,02-0,5% случаев.
Иммуноблотинг используют при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве экспертного метода. ИБ сочетает в себе определение антител к отдельным белкам вируса с предварительным электропереносом антигенов на нитроцеллюлезную полоску.
Окончательное решение вопроса о диагнозе возможно при проведении более высокочувствительных, экспертных методов исследования: полимеразной цепной реакции, ДНК-зондов или культивирования вируса. Из серологических методов при неопределенных результатах ИБ для экспертной диагностики используют радиоиммунопреципитацию (РИП).
РИП основана на использовании белков вируса, меченных радиоактивным йодом, а преципитаты выявляют с помощью бета-счетчика. К недостаткам метода относится высокая стоимость исследования.
Наиболее доступен для практической работы метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием специальных клеточных линий, инфицированных ВИЧ. Клетки фиксируют на предметных стеклах с помощью ацетон-метанола, убивающего вирус, но сохраняющего его поверхностные антигены. С последними взаимодействуют антитела сыворотки инфицированного.
В США применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
- ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) - тест первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью по сравнению с нижеследующими,
- Western-blot (иммунный блотинг) - весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ-2,
- антигенемия р25 - тест, эффективный на начальных стадиях заражения. Твердофазный ИФА позволяет выявить даже несколько пикограммов антигена p25. Образование комплексов между p24 и эндогенными антителами снижает чувствительность метода. Для расщепления иммунных комплексов их обрабатывают кислотой. Этот метод используется при обследовании больных, когда антитела к ВИЧ отсутствуют.
Внедрение метода полимеразной цепной реакции существенно обогатило лабораторную диагностику вирусных инфекций. ПЦР - относительно новый метод, основанный на амплификации ДНК или РНК вируса. Основное преимущество этого метода заключается в его чувствительности, позволяющей определить минимальное количество нуклеиновых кислот. Однако высокая чувствительность не позволяет применять этот метод для исследования проб, загрязненных другими микробами. В связи с этим ПЦР проводят лишь в специализированных лабораториях, строго соблюдая условия стерильности. ПЦР относится к количественным методам исследования вирусного генома, поэтому может быть использована для оценки эффективности лечения.
Другой метод анализа ДНК, так называемый метод разветвленной ДНК, основан на применении синтетической ДНК, которая содержит один участок, комплементарный фрагменту вирусной РНК, и множество участков, комплементарных искусственно созданному олигонуклеотидному зонду, меченному люминесцентным красителем. Этот метод менее чувствителен, чем ПЦР, однако более прост, а применение хемилюминометра позволяет быстро оценить его результаты. Существуют и другие методы анализа нуклеиновых кислот ВИЧ. Диагностика ВИЧ, основанная на исследовании вирусного генома, проводится только в специализированных лабораториях.
Выделение вируса из крови - очень чувствительный и специфичный способ диагностики ВИЧ-инфекции. Вирус можно также определить в культуре лимфоцитов и моноцитов больного. Поскольку эти методы сложны и требуют больших материальных затрат, в настоящее время они применяются лишь в научных целях.
Основным клинико-лабораторным показателем диагностики СПИДа среди ВИЧ-инфицированных стало определение содержания СD4-лимфоцитов: уровень ниже 200 клеток/мкл является основным критерием диагноза СПИДа. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством СD4-лимфоцитов 200 клеток/мкл и менее нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. Хотя у 1/2 ВИЧ-инфицированных с количеством СD4-лимфоцитов менее 200 клеток/мкл отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что симптомы у них развиваются в ближайшие 2 мес, поэтому в таких случаях диагностируют СПИД.
В оценке показаний к началу активной антиретровирусной терапии или ее изменению как основополагающие должны быть использованы совместно тесты по выявлению вирусной нагрузки на плазму (определение вДНК и RT-PCR) и уровня СD4-клеток.
Рекомендуется вирусную нагрузку на плазму определять каждые 3-4 мес, а число СD4-клеток — каждые 3-6 мес. Эти тесты обязательны перед началом терапии или ее изменением через 4-8 нед спустя от начала терапии.
Диагностика ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
Клиническая диагностика. Дифференциальный диагноз
Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции обеспечивает своевременность терапии больного и развертывание профилактических мероприятий в очаге, предупреждающих неумышленную передачу вируса от инфицированного здоровому человеку. Наконец, ранняя диагностика позволяет своевременное проведение диспансеризации, психологической помощи, социальной реабилитации. Первые успехи в терапии больных позволяют при ранней диагностике значительно продлить жизнь больным и даже надеяться на излечение.
Сложность ранней диагностики, базирующейся на клинической картине заключается в неспецифичности, полиморфности симптоматики в стадии II, уже не говоря об отсутствии клиники в стадии I. Тем не менее во всех случаях немотивированной утомляемости, наличия ночных потов, головной боли, особенно на фоне кратковременной лихорадки (3-10 дней) с температурой 38-38,50 С, сопровождающейся тонзиллитом, длительного диарейного синдрома, похудания за короткое время, необходимо в первую очередь исключить ВИЧ-инфекцию. Постановке диагноза в этот период помогает выявление при объективном обследовании разнообразной кожной сыпи (пятна, папулы, розеолы, гнойнички) или фурункулеза. Наличие лимфаденопатии, даже в случаях увеличения одной группы лимфатических узлов и тем более при генерализованной уже с большей долей вероятности позволяет заподозрить клинически ВИЧ-инфекцию. Для болезни особенно характерно увеличение заднешейных, подчелюстных, над- и подключичных, подмышечных и локтевых лимфатических узлов. Как правило, они увеличиваются размером до 2-5 см в диаметре, безболезненны, плотно-эластичной консистенции, изредка сливаются в конгломерат. Весьма характерно для ВИЧ-инфекции увеличение более чем одного узла, более чем одной группы (за исключением паховых), длящееся свыше 3 мес.
Нередко в ранней фазе болезни наличие психо-неврологической симптоматики: чувство тревоги, депрессия, шаткость походки, снижение остроты зрения, судорожные припадки с признаками поражения психо-эмоциональной сферы (нарушение памяти, забывчивость, неадекватность поведения, притупление эмоций). К наиболее характерным признакам ранней стадии ВИЧ-инфекции относятся:
1. Снижение массы тела менее, чем на 10%;
2. Изменения на коже и слизистых оболочек (себорйный дерматит, фолликулит, пруриго, псориаз, грибковые поражения ногтей, рецидивирующие язвы в полости рта, некротический гингивит);
3. Опоясывающий герпес у лиц моложе 50 лет;
4. Рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей;
В промежуточной стадии болезни, характеризующейся клиникой развернутой суперинфекции, сформировавшейся в результате иммунодефицита наиболее характерны:
1. Прогрессирующее снижение массы тела свыше 10%;
2. Диарея неясного генеза, продолжающаяся свыше 1 мес..;
3. Кандидоз полости рта;
4. Лейкоплакия;
5. Туберкулез легких;
6. Периферическая нейропатия;
7. Локализованные формы саркомы Капоши;
8. Диссеминирующий опоясывающий герпес;
9. Тяжелая, рецидивирующая бактериальная инфекция (пневмония, синуситы, пиомиозит).
Для поздней стадии, позволяющей диагностировать ВИЧ-инфекцию, или, во всяком случае, проводить дифференциальную диагностику, относятся:
1. Пневмоцистная пневмония;
2. Токсоплазмоз;
3. Криптококкоз;
4. CMV-инфекция;
5. Простой герпес;
6. Прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия;
7. Гистоплазмоз;
8. Кандидозный эзофагит;
9. МАК-инфекция;
10. Сальмонеллезная септицемия;
11. Внелегочной туберкулез;
12. Лимфома, саркома Капоши;
13. Кахексия;
14. ВИЧ-энцефалопатия.
В 1988 ВОЗ предложила в целях клинической диагностики проводить балловую оценку симптомов, имеющихся у подозреваемого на ВИЧ-инфекцию больного:
- Персистирующая генерализованная лимфаденопатия0
- Изменения на коже и слизистых оболочках1
- Снижение массы тела1
- Выраженная утомляемость1
- Простой герпес2
- Диарея длительностью свыше 1 мес.4
- Лихорадка длительностью свыше 1 мес. 4
- Снижение массы тела свыше 10%4
- Туберкулез легких 5
- Рецидивирующая бактериальная инфекция5
- Лейкоплакия полости рта5
- Стоматит, молочница рта5
- Локализованная саркома Капоши8
- Кахексия12
При этом сумма баллов от 0 до 3 оценивается как вероятность ВИЧ-инфекции очень мала, 4 -11 баллов - заболевание вероятно, а 12 и свыше - очень вероятно.
В целом клиническая диагностика ВИЧ-инфекции – это, прежде всего диагностика спектра СПИД-ассоциированной патологии у больного вторичным иммунодефицитом. Так как ВИЧ-индикаторные заболевания включают 23 нозологические формы, наиболее целесообразен синдромальный подход к диагностике. Почти всегда имеет место у больного синдром общей интоксикации (немотивированная слабость, вялость, быстрая утомляемость) развивающийся на фоне длительного субфебрилитета или лихорадки неясного генеза, чаще в ночное и утреннее время, сопровождающейся обильным потом. Постоянен синдром немотивированной генерализованной периферической лимфаденопатии, в 20% сопровождающийся гепато- спленомегалией различной степени выраженности. Один из ведущих синдромов болезни - синдром бронхо-легочной патологии, правда глубокие поражения легочной ткани в виде пневмоцистной пневмонии развиваются в далеко зашедших случаях болезни, ибо развивается пневмоцистоз на фоне глубокого иммунодефицита. Зато длительностью свыше 1 месяца синдром немотивированной диареи относится к рано появляющимся, для него характерна устойчивость к медикаментозной терапии. Один из синдромов ВИЧ-инфекции - волнообразно текущая артралгия неясной этиологии. К характернейшим проявлениям болезни следует отнести и синдром поражений кожи и слизистых, проявляющийся неспецифической макуло-папулезной сыпью, устойчивой к терапии стероидами экземой, стафилококковым импетиго. К дерматологическим проявлениям также относятся рецидивирующие грибковые (микоз, кандидоз, бактериальные (фолликулиты, фурункулез, гидроаденит), вирусные (герпес) поражения кожи и слизистых оболочек. Наконец, ВИЧ-инфекцию характеризуют и новообразования, в основном в виде саркомы Капоши и лимфомы, а также некоторых других видов опухолей.
Наличие у пациента не менее двух клинических и двух клинико-лабораторных (лейко- лифо- нейтропения, гипогаммаглобулинемия) из числа вышеперечисленных симптомов позволяет с высокой степенью уверенности диагностировать ВИЧ-инфекцию. Но в то же время в случае выявления двух из таких весьма часто встречающихся у больных синдромов, как лихорадка и лимфаденопатия, сохраняющихся на протяжении месяца и свыше, стойкая немотивированная диарея, снижение массы тела более чем на 10% или обильные ночные поты дают основание на постановку диагноза и тщательного лабораторного обследования.
В стадии I заболевание можно заподозрить только по симптому персистирующей генерализованной лимфаденопатии у больного из группы риска или при наличии эпиданамнеза.
В стадии II (ранней или слабовыраженной) еще сохраняется соматическое благополучеие, нормальная активность. Поражения кожи и слизистых оболочек нетяжелые, рецидивирующие инфекции респираторного тракта не носят генерализованного характера, потеря массы тела не превышает 10%.
Согласно рекомендациям ВОЗ, надежная клиническая диагностика ВИЧ-инфекции у взрослых и детей возможна при наличии одного из 12 СПИД-индикаторных заболевания: 1) кандидоз пищевода, трахеи, бронхов, легких; 2) внелегочной криптококкоз; 3) криптоспоридиоз с диареей более одного месяца; 4) цитомегаловирусное поражение какого-либо органа (за исключением и помимо печени, селезенки и лимфатических узлов у больного старше 1 месяца); 5) инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, персистирующая более 1 месяца у больного старше 1 месяца; 6) саркома Капоши у больного моложе 60 лет; 7) лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет; 8) лимфоцитарная интерстициальная пневмония у ребенка до 13 лет, 9) диссеминированная инфекция, вызванная бактериями группы Micobacterium avium intracellulare или M.Kansassii; 10) пневмоцистная пневмония; 11) прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия; 12) токсоплазмоз центральной нервной системы у больных старше 1 месяца. Наличие одного из этих заболеваний позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию при отсутствии серологического иммуноферментного исследования крови или даже при получении серонегативного результата.
Не менее сложна дифференсация фаз болезни, т.е. разграничение стадий по клиническим критериям. По мнению специалистов CDC (США) наиболее объективный критерий - количество Т-хелперов, а не клинические проявления, ибо многие из этих состояний часто встречаются у лиц, не инфицированных ВИЧ. В 1991 году Центр определил, что постановка диагноза СПИД может быть в случаях, если: а) у инфицированного имеется одно из 23 СПИД-ассоциированных состояний или б) он ВИЧ-инфицирован и имеет менее 200 СD4+ клеток/ мм.
Лабораторная диагностика
Обследованию на ВИЧ-инфекцию в первую очередь подлежат:
2. Лица с клиникой кандидозного эзофагита, кандидоза бронхов и легких, диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза, пневмоцистной пневмонии, внелегочного криптококкоза, криптоспоридиоза с диареей юлительностью свыше 1 мес., цитомегаловирусного поражения внутренних органов кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 6 мес., цитмегаловируснго ретинита с потерей зрения, герпетической инфекции с многоочаговыми язвами длительностью свыше 1 мес., бронхитом, пневмонией или эзофагитом, рецидивирующего опоясывающего герпеса, дессиминированного или внелегочного гистоплазмоза, туберкулеза легких или внелегочного, изоспориоза с диареей длительностью свыше 1 мес., распространенной или внелегочной МАК-инфекции, прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии, токсоплазмоза мозга, сальмонеллезной септицемии, саркомы Капоши, лимфомы, лимфоидной интерстициальной пневмонии (у детей)
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции базируется на трех направлениях: а) индикация ВИЧ и его компонентов, б) выявление анти-ВИЧ, в) определение изменений в иммунной системе.
Среди существующих методов лабораторной диагностики наиболее распространены серологические - выявление антител к антигенам вируса.
В состав ВИЧ входят структурные гены gag (group-specific-antigens), pol (polymerase) и env (envelope), кодирующие трансляцию белков, из которых строится вирус. Группу регуляторных генов ВИЧ составляют tat, трансактиватор всех вирусных белков, rev, регулирующий экспрессию вирусных белков, vif, являющийся вирусным инфекционным фактором, nef - негативный фактор экспрессии и vpx и vpr, функция которых пока не установлена. Ген gag кодирует белки сердцевины вируса и первичным продуктом трансляции его является р53 - белок-предшественник, расщепляющийся на три (р15, р17 и р 24) или с образованием при расщеплении первоначально промежуточного белка р39, который затем расщепляется на белки р17 и р24. У ВИЧ-инфицированных в большинстве случаев образуются антитела именно к этим антигенам, причем антитела к р24 выявляются на ранней стадии инфекции, ибо р24 более иммуногенен, чем р17. Ген роl кодирует белки р51/66 и р31, представляющие собой реверстранскриптазу и эндонуклеазу вируса.
Для выявления антител при ВИЧ-инфекции в основном используют иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ). В первом случае выявляются суммарные антитела к белкам ВИЧ, во втором - к отдельным белкам (табл. 54). В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, на которые сорбируются антитела больного, а комплекс антиген-антитело выявляется с помощью коньюгата антивидового иммуноглобулина с ферментом. Метод довольно специфичен (99%) и достаточно чувствителен (93-99%), позволяет выявлять вирусспецифические антитела у 95% инфицированных. Отрицательные 5% случаев приходится на ранние этапы инфицирования, когда антител еще мало в сыворотке крови или на терминальные фазы болезни, когда организм уже не в состоянии синтезировать антитела в силу резкого истощения иммунной системы. Кроме того в ходе инфекционного процесса наблюдаются периоды исчезновения антител из крови, что также обусловливает отрицательные результаты ИФА. Наоборот, возможны ложноположительные данные ИФА, в основном у больных с аутоиммунными заболеваниями, при инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр, когда происходит перекрестная реакция антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейн-Барр или к молекулам главного комплекса гистосовместимости. Встречаются подобные ложноположительные реакции в 0,02-0,5% случаев.
Таблица 54. Выявление антител к белкам, кодируемым генами ВИЧ
Гены ВИЧ Белки-продуценты генов ИФА Иммуноблот
Определение суммарных антител к белкам ВИЧ Определение антител к отдельным белкам
GAG р15, р17, р24, р55 - II - - II -
POL р31, р51, р66 - II - - II -
ENV gp41, gp120, gp160 - II - - II -
Сравнительно высокий процент ложно-положительных реакций в ИФА в данном случае объясняется качеством тест-систем, но расхождения даже ниже, чем в экономически развитых странах. Сейчас внедряется в практику тест-системы 3-4 поколения, в основе которых лежит использование в качестве антигена: а) лизатов ВИЧ-1, б) рекомбинантных белков ВИЧ-1, в) введение антигенов субтипа “О” ВИЧ-1, г) коньюгаты, позволяющие определять IgM, IgG, IgA. Все это снижает частоту ложноположительных реакций ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции, дает возможность раннего выявления сероконверсии. Улучшение тест-систем, выпускаемых некоторыми фирмами, обусловило более высокую чувствительность, чем иммунный блот, используемый для подтверждения специфичности ИФА. Поэтому ИФА с некоторыми тест-системами может использоваться не только как метод для скрининговых исследований, но и подтверждающих.
Антитела к основным внутренним белкам (р17, р24) обнаруживаются у 3/4 инфицированных и примерно у половины больных СПИДом.
Иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве экспертного метода. ИБ сочетает в себе определение антител к отдельным белкам вируса с предварительным электропереносом на нитроцеллюлезную полоску (стрип) антигенов. В ИБ чаще всего выявляются антитела против gp41, обнаружение же в ИБ антител против р24 при профилактических обследованиях не дает оснований для окончательного решения вопроса об нфицировании. Используемый в последнее время рекомбинантный белок для ИБ улучшает оценку результатов. Ход лабораторной диагностики, применяемой в нашей лаборатории, предствлен на рис. 21.
По нашим данным при использовании тест-систем ведущих фирм мира у больных ВИЧ-инфекцией в иммунном блотинге во всех случаях выявляются антитела к gp160 и лишь у трети (38,8%) к р15 (табл.55).
Таблица 55. Выявляемость антител к белкам ВИЧ в иммунном блоте
Антитела к белкам ВИЧ % выявления Антитела к белкам ВИЧ % выявления
gp160 100 gp41 84,4
gp120 91,1 p31-34 84,4
p65-68 93,3 p24-25 100
p55-52 93,0 p17-18 80,0
p51 p17-18 38,8
ВОЗ (1991) предлагает следующий принцип оценки результатов иимунного блота: а) положительный результат - обнаружение в сыворотке крови антител к двум вирусным белкам из группы env с наличием или отсутствием белков - продуцентов gag и pol; б) отрицательный результат - отсутствие каких либо антител и в) неопределенный результат - обнаружение в сыворотке крови антител к белкам из группы gag и pol. Чаще всего неопределенный результат связан с белками- продуцентами экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/17, р24 и р55, ибо в этих случаях возможны или инфицирование или ложноположительный результат. В подобных случаях, если обследуемый не относится к группе риска, а повторный анализ не дает нарастания титра антител, скорее всего человек не инфицирован. Окончательное же решение вопроса о диагнозе возможно только при проведении более высокочувствительных, экспертных методов исследования: пероксидазной цепной реакции, ДНК-зондов или культивирования вируса. Среди серологических методов в случае неопределенных результатов ИБ используется в качестве экспертной диагностики радиоиммуно-преципитация (РИП).
В основе РИП лежит использование белков вируса, меченых радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относятся дорогостоящая аппаратура, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.
Рис. 21. Этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
Более доступен метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием специальных клеточных линий, инфицированных ВИЧ. Чаще всего используют клеточные линии MOLT, H9, CEM и др. Клетки фиксируют на предметных стеклах с помощью ацетон-метанола, убивающего вирус, но сохраняющего его поверхностные антигены. С последними взаимодействуют антитела сыворотки инфицированного.
Интерпретация серодиагностики ВИЧ-инфекции представляет иногда определенные трудности. Так, при применении твердофазного ИФА (ELISA) необходимо ставить реакцию параллельно набором тестов (ELISA Biatest Mixte, ELISA Abott Mixte, ELISA Behring Mixte), ибо встречаются ситуации, когда два теста ELISA могут быть отрицательными, а третий в последующем положительным при повторном обследовании, что подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Аналогичная ситуация наблюдается при использовании теста Western-Blot.
Большие трудности интерпретации результатов при перекресных реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии. В первой ситуации при повторном исследовании через определенный промежуток времени антитела не выявляются, а во втором в иммуноблоте появляются новые полосы, свидетельствующие о появлении антител к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя динамику ответной иммунной реакции на антигены вируса.
В США применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
ELISA - тест (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими,
Western-blot (иммунный блотинг) - весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ- 2,
Антигенемия р25 - тест, эффективный в начальных стадиях заражения.
Внедрение метода полимеразной цепной реакции существенно обогатили лабораторную диагностику вирусных инфекций, в том числе и ВИЧ-инфекции. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является циклическим процессом увеличения в геометрической прогрессии копии ограниченного синтетическими олигонуклеотидами (праймерами) определенного специфического фрагмента ДНК, протекающей под воздействием термостабильной ДНК-полимеразы при строго заданных температурных и временных характеристиках (White T.J. et al.,1989). Чувствительность ПЦР зависит от специфичности, с которой олигонуклеотиды синтезируют необходимый участок ДНК по отношению к другим неспецифическим участкам нуклеиновой кислоты. Использование различных вариантов ДНК - ДНК-гибридизации с олигонуклеотидными зондами, имеющих ту или иную метку (радиоактивную, флюоресцентную и т.д.) значительно увеличивает чувствительность и специфичность определения продуктов амплификации. Метод гибридизации нуклеиновых кислот весьма высокоспецифичен, однако без проведения амплификации не всегда чувствителен, ибо в крови не велико количество инфицированных клеток. Сочетание двух методов позволило проводить анализ с минимальным количеством материала. В ПЦР может быть использована ДНК, выделенная из свежеполученного материала (кровь, ткани), а также из замороженного, высушенного или фиксированного.
Основным клинико-лабораторным показателем диагностики СПИДа среди ВИЧ-инфицированных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+ лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+лимфоцитов 200 клеток/ мм и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством СD4+ лимфоцитов менее 200 клеток/мм отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 месяца, поэтому они все расцениваются как больные в стадии СПИДа.
В специализированных лечебных учреждениях, в странах с высоким экономическим потенциалом обычно используют комбинацию нескольких лабораторных тестов.
J.W. Mellors, A. Munoz, J.V. Giorgi et al. (1997) в 4 университетских клинических центрах США с 1984 по 1985 г. наблюдали 4954 мужчины-гомосексуалиста 18 лет без клинических признаков СПИДа. Затем среди них отобрали 1813 участников с исходной серопозитивной реакцией на ВИЧ и 169 участников с сероконверсией, выявленной в течение 18 мес с момента включения в исследование. Из них только у 1604 (81%) участников число клеток CD4+ и уровень РНК ВИЧ-1 определялись как в начале исследования, так и в ходе наблюдения. Медиана продолжительности наблюдения за участниками, у которых не развился СПИД, составила 9,6 года. В качестве прогностических тестов определяли число лимфоцитов CD4+, СD3+ и СD8+; уровень РНК ВИЧ-1, b2-микроглобулина и неоптерина в крови; среди клинических показателей - кандидозный стоматит или лихорадка в течение 2 или более нед. Критерием оценки являлось время до развития СПИДа и до наступления связанной с ним смерти.
За время наблюдения у 998 больных развился СПИД, 855 больных умерли от него. Прогнозировать прогрессирование ВИЧ-инфекции можно было по уровням РНК ВИЧ-1, неоптерина, b2-микроглобулина и числу клеток CD4+. Относительный риск развития СПИДа и смерти от него прямо коррелировал с уровнем РНК ВИЧ-1. Оценка ожидаемого клинического исхода была более точной, когда с показателем вирусной нагрузки на плазму учитывали число клеток CD4+,. Прогностическая ценность показателей не не зависела от применения антиретровирусных препаратов.
Авторы пришли к выводу, что уровень РНК ВИЧ-1 лучше всего позволяет прогнозировать клинический исход при ВИЧ-инфекции, число клеток CD4+ в этом смысле менее информативно. Однако прогноз наиболее точен при совместном использовании двух этих показателей. Так, при уровне РНК ВИЧ-1 Ј500 копий/мл прогрессирование ВИЧ-инфекции до СПИДа через 9 лет наблюдалось у 3,6% больных, если число клеток CD4+ было >650/мм3, и у 22,1%, если число клеток CD4+ было менее 750/мм3. Точно так же, если уровень РНК ВИЧ-1 превышал 30 000 копий/мл, частота прогрессирования ВИЧ-инфекции через 9 лет при исходном числе клеток CD4+ >500, 351-500, 201-350 и менее 200/мм3, была равна соответственно 76,3%, 94,4%, 92,9% и 100%. Хотя 60% участников в последующем принимали антиретровирусные препараты, исходные показатели концентрации ВИЧ сохраняли свою прогностическую ценность независимо от дальнейшего лечения.
Полученные результаты
подчеркивают важность интерпретации результатов определения концентрации ВИЧ с
учетом как клинического состояния, так и числа клеток CD4+. Этот показатель не
только помогает принять решение о времени начала антиретровирусной терапии, в
других исследованиях была продемонстрирована его роль в оценке эффективности
различных схем антиретровирусной терапии и в определении момента изменения лечебной тактики перед
развитием клинической недостаточности . Но при использовании этого показателя следует проявлять
осторожность, поскольку различные наборы реактивов для количественного
определения уровня РНК ВИЧ могут давать различные результаты; кроме того,
концентрацию вируса не следует определять во время или вскоре после успешного
лечения ВИЧ-инфекции.
/ 11
ХудшийЛучший
Обследованию на ВИЧ-инфекцию подлежат:
2. Лица с подозрением или подтвержденным диагнозом: бактериальной инфекции у детей младше 13 лет, множественной и рецидивирующей; кандидоза пищевода, трахеи, бронхов или легких; цервикального инвазивного рака; диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза; криптококкоза внелегочного; криптоспоридиоза с диареей в течение 1 мес и более; цитомегаловирусного поражения других органов, кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 1 мес; цитомегаловирусного ретинита с потерей зрения; герпетической инфекции, вызывающей многоочаговые язвы, которые не излечиваются на протяжении 1 мес, или бронхит, пневмонию, эзофагит; гистоплазмоза диссеминированного или внелегочного; изоспороза с диареей свыше 1 мес; туберкулеза распространенного или внелегочного; туберкулеза легких у взрослых или подростков старше 13 лет; туберкулеза внелегочного; другого заболевания, вызванного микобактериями, кроме М. tuberculosis диссеминированного или внелегочного; пневмонии, вызванной пневмоцистами; прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии; сальмонеллезной (кроме Salmonella typhi) септицемии, рецидивирующей; токсоилаз-моза мозга у детей старше 1 мес; саркомы Капоши; лимфоидной интерстициальной пневмонии у детей младше 13 лет; лимфомы Беркитта; иммунобластной лимфомы; первичной лимфомы мозга; синдрома истощения, гепатита В, носительства HBsAg; инфекционного мононуклеоза; рецидивирующего опоясывающего герпеса у лиц старше 60 лет; болезней, передающихся половым путем.
В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:
а) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;
б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.
Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:
а) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;
б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;
в) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.
Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу. Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики. Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.
В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;
Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ - 2;
Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сыворо-ток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.
При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является основным и наиболее широко применяемым методом определения антител к ВИЧ. Но к недостаткам применения ИФА в серодиагностике ВИЧ-инфекции следует отнести частые ложноположительные результаты. В связи с этим результат в ИФА не является основанием для заключения о ВИЧ-серопозитивности обследуемого. Это связано с недостаточной очисткой иммуносорбента от балластных белков; спонтанным связыванием антител сыворотки с пластиком, если его участки, не занятые иммуносорбентом, недостаточно блокированы или не блокированы совсем специальным нейтральным белком; перекрестным взаимодействием с ВИЧ-белками иммуносорбента различных протеинов, присутствующих в крови лиц с определенными, чаще аутоиммунными патологическими процессами типа рассеянного склероза, СКВ, туберкулеза; с частым донорством, инфекционными и онкозаболеваниями, ожогами, беременностью, повторными гемотрансфузиями, пересадкой органов, тканей, а также лиц, находящихся на гемодиализе; с присутствием в крови ревматоидного фактора, часто провоцирующего ВИЧ-ложноположительные реакции; наличием в крови обследуемых людей антител к gag-белкам ВИЧ и прежде всего к белку р24 (очевидно, образуются антитела к экзо-или эндогенным не идентифицированным еще ретровирусам). Так как анти-р24 синтезируются в обязательном порядке на ранних стадиях ВИЧ-сероконверсии, проводится дальнейшее иммунологическое наблюдение за лицами с антителами к gag-белкам ВИЧ, а также отстранение их от донорства.
Чувствительность и специфичность иммуноферментно-го анализа постоянно повышаются. В результате ИФА четвертого поколения не уступают по своим диагностическим возможностям иммунному блотингу и могут быть использованы не только на скрининговом, но и на подтверждающем этапе диагностики ВИЧ-инфекции [Смольская Т. Т., 1997].
Иммуноблотинг является конечным методом серологической диагностики, позволяющим сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности или негативности обследуемого.
Существует четкая корреляция между результатами исследования сывороток в иммуноблоте и ИФА - дважды положительные в ИФА с разными тест-системами сыворотки в 97-98% случаев оказываются затем ВИЧ-позитивными в иммуноблотинге. Если же сыворотки оказались положительными в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-систем, в иммуноблоте они выявляются положительными лишь в 4% случаев. В 5% случаев при проведении подтверждающих исследований у лиц с положительными данными ИФА-иммуноблот может давать «неопределенные» результаты, а среди них примерно в 20% случаев «неопределенные» результаты вызывают антитела к gag-белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). Наличие антител только к gag-белкам ВИЧ-1 является поводом для дополнительного обследования сыворотки крови на инфицирование ВИЧ-2.
Оценка результатов иммуноблотинга осуществляется строго в соответствии с прилагаемой к тест-системе инструкцией. В случае отсутствия в инструкции указаний по интерпретации результатов следует использовать критерии ВОЗ.
При получении положительных результатов исследований на референтном этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и отрицательном результате исследования методом иммунного блотинга проводится обязательная повторная экспертная диагностика через 6 мес после первого обследования.
Если результаты иммуноблотинга через 12 мес после исследования первой пробы остаются отрицательными или неопределенными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, обследуемого снимают с диспансерного наблюдения.
Среди серологических методов в случае неопределенных результатов иммуноблота используется в качестве экспертной диагностики радиоиммунопреципитация (РИП). В основе ее лежит использование белков вируса, меченных радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относится дороговизна аппаратуры, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.
Лица, у которых диагностирована ВИЧ-инфекция, подлежат постоянному динамическому наблюдению с обязательным лабораторным обследованием каждые 6 мес.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет предварительно умноженные нуклеотидные последовательнос-ти, специфичные для генома данного возбудителя. Изолированное умножение гена или его фрагмента, называемое амплификацией, ПЦР дает возможность осуществлять в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы. За 2-3 часа ПЦР позволяет получить миллионы копий специфического участка вируса. При ВИЧ-инфекции из клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными «зондами» получают достаточное для анализа количество провирусной ДНК, которую выявляют и характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических для вируса аминокислотных последовательностей. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток.
ПЦР, в том числе количественная, может быть исполь-зовна только в целях определения вирусной нагрузки на плазму для решения вопроса начала медикаментозного лечения больного или смены антиретровирусных лекарственных препаратов. ПЦР не может быть рекомендована для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, так как даже самые ультрасовременные методы ее постановки и реактивы позволяют определить вирусную нагрузку не ниже определенного уровня - 50 копий/мл. А сложность постановки ПЦР и ее дороговизна (около 200 долларов) сводят на нет ее широкомасштабное использование как метода повседневной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Таким образом, ПЦР остается незаменимой только для оценки вирусной нагрузки на плазму у больных с уже установленным диагнозом ВИЧ-инфекции в целях решения вопроса терапии больных.
Схематично этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции представлены на рис. 1.
Рис. 1. Этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
В течение ВИЧ-инфекции существует период «темного лабораторного окна», когда количество антител против ВИЧ является недостаточным для чувствительности тест-систем. Период этот колеблется от одной недели до трех месяцев от момента заражения ВИЧ в зависимости от уровня чувствительности тест-системы. С учетом этого явления возникают сложности при обследовании донорской крови от лиц, пребывающих в упомянутом периоде ВИЧ-инфицирования. Поэтому в большинстве стран мира введена система использования крови только после ее хранения на протяжении 3-6 мес с целью осуществления обязательного повторного обследования на ВИЧ-инфекцию доноров данных доз крови и ее компонентов.
Стадия первичных проявлений характеризуется активностью репликативного процесса. Возникающие виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM: анти-р24, aнти-gp41, aнти-gp120. Антиген р24 у части инфицированных может быть выявлен в крови методом ИФА уже через 2 нед после заражения и определяться до 8-н недели. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24, он приходится на период формирования стадии СПИД.
Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ gp41, р24, gpl20, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Большинство коммерческих наборов рассчитано на индикацию именно таких антител.
Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови израсходованы на связывание вирусных частиц, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител.
У лиц с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. Вместе с тем у таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антителами вирионов и растворимых белков ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов.
Несмотря на обилие специфических маркеров ВИЧ-инфекции, наиболее часто определяемым является наличие суммарных антител к белкам ВИЧ. Термин «суммарный» подразумевает присутствие двух классов антител (IgG и IgM) и широкий спектр антител к различным, в первую очередь к структурным, белкам ВИЧ.
Определение СD4-клеток. Основным клинико-лабораторным показателем диагностики стадии ВИЧ-инфекции, степени разрушения иммунной системы у больных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+-лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм3 является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+-лимфоцитов 200 клеток/мм3 и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством С04+-лимфоцитов менее 200 клеток/мм3 отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 мес, поэтому они все расцениваются как больные на стадии СПИДа.
Лабораторная диагностика СПИДа
Подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции можно с помощью различных лабораторных методов, которые позволяют выделить вирусы; выявить антитела к ВИЧ; обнаружить антигены ВИЧ.
Для выделения ВИЧ используют различные культуры лимфоцитов. Выделение вируса производится из крови, лимфы, пунктата лимфатических узлов, семенной жидкости, молока кормящей матери, слюны, мокроты, мочи, цервикалного отделяемого, кала. Чувствительность данного метода относительно невысока, к тому же он трудновыполним, поэтому метод изоляции ВИЧ применяется пока только в научно - исследовательских целях.
Значительные преимущества имеет метод ДНК – зондов . В основе метода получение клонированных участков вирусного генома, меченых радиоактивными маркерами или ферментными зондами. Он позволяет проводить молекулярно-биологическое выявление маркеров ВИЧ без дополнительного культивирования.
Для выявления антител к ВИЧ применяется несколько методов:
Иммуноферментный анализ;
Иммуноблотинг;
Иммунофлюоресценция;
Радиоиммунопреципитация;
Агглюцинация.
Самым простым, доступным и широко применяемым в практике является иммуноферментный анализ (ИФА) на выявление антител к вирусу СПИДа в крови больных. По сравнению с выделением вируса метод ИФА обладает значительно более высокой чувствительностью, однако менее специфичен из-за возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
Антитела к ВИЧ появляются у 90- 95% инфицированных в течение 3 месяцев после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев и у 0,5-1% - в более поздние сроки. С развитием заболевания количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения .
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. Материал нельзя длительно хранить, так как наступивший гемолиз (разрушение эритроцитов) повлияет на результаты анализа. Поэтому после взятия крови желательно отделить сыворотку, которая может храниться в холодильнике до 7 дней.
Метод ИФА является скрининговым (проверочным). В случае положительного результата анализ в лаборатории проводится дважды (с той же сывороткой) и при получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется для постановки подтверждающего теста.
Иммуноблотинг - тестирование на наличие антител к отдельным вирусным антигенам. Метод иммуноблотинга используется для подтверждения специфичности результата , полученного методом ИФА. Иммуноблотинг позволяет выявить в сыворотке крови инфицированных оболочечные и регуляторные белки ВИЧ. Однако и данный метод иногда дает ложноположительные реакции, например, при исследовании крови больных тропической малярией.
Метод иммунофлуоресценции относительно прост, в качестве антигенов в этой реакции используются различные клеточные линии инфицированных ВИЧ.
Радиоиммунопреципитация - один из наиболее специфичных и чувствительных методов диагностики СПИДа, однако, для него требуются дорогостоящие радиоактивные материалы и оборудование. Кроме того, для постановки реакции необходимо культивировать инфицированные вирусом клетки.
Метод агглюцинации является одним из наиболее простых, чувствительных и специфичных для определения антител к ВИЧ.
Обнаружение антигенов ВИЧ в исследуемом материале основано, главным образом, на тех же принципах, что и выявление антител. Однако существующие методы не позволяют регулярно обнаруживать антигены в материалах, полученных от больных, из-за их низкого содержания .
В ряде лабораторий некоторых стран изучается диагностическая ценность новой реакции - энзимной амплификации генов . Эта реакция важна для; уточнения диагностики врожденного СПИДа, так как она позволяет выявлять клетки, пораженные вирусом, а не антитела .
В последние годы решающее значение для прогноза и тяжести ВИЧ - инфекции имеет определение «вирусной нагрузки» (viral load) - определение количества копий РНК ВИЧ в плазме методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Используется определение и других вирусологических маркеров.
Для практических целей иногда применяют клинико-морфологическую классификацию форм СПИДа:
Легочная;
Желудочно-кишечная;
Церебральная;
Диссеминированная.
Легочная форма проявляется одышкой, гипоксией, болью в области груди. При ренгенологическом исследовании в легких обнаруживают диффузные инфильтраты. Самой частой инфекцией, приводящей к смерти больных, является пневмония. Тяжелую клиническую картину дают инфекции легких, вызванные легионеллами, цитомегаловирусом и другими микроорганизмами. Для таких пневмоний характерны вялость течения, высокая частота рецидивов после прекращения лечения.
Желудочно-кишечная форма сопровождается диареей, тошнотой, рвотой, снижением массы тела; связана с инфекциями, вызываемыми Cryptosporidium и другими микроорганизмами. Перемежающаяся или непрерывная диарея в течение 2-3 месяцев плохо поддается лечению. В некоторых случаях образуются болезненные, кровоточащие язвы желудка или кишечника. У некоторых больных СПИД протекает в форме лихорадки неизвестной этиологии, сопровождается стоматитом, поражениями пищевода, усиленным потоотделением ночью, недомоганием, слабостью, потерей массы тела до 10-15 кг.
Церебральная форма СПИДа встречается у 30% больных. При этой форме регистрируются вторичные инфекции ЦНС: менингиты, абсцессы мозга, острые и подострые энцефалиты, прогрессирующая лейкоэниефалопатия; опухоли головного мозга (первичные или вторичные лимфомы); сосудистые осложнения, ассоциированные с тромбоцитопенией; очаговые поражения ЦНС в форме доброкачественно протекающего менингита. Около трети больных СПИДом страдают деменцией до развития тяжелого слабоумия. Возбудителями патологических процессов в головном мозгу выступают токсоплазмы, криптококки, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, аденовирусы, вирус гриппа, вирус герпеса.
Диссеминированная форма проявляется поражением кожи и слизистых оболочек. При этой форме развиваются злокачественные опухоли более чем у 30% больных, а именно саркома Капоши, которая является одной из форм течения СПИДа. Источником развития опухоли служат ретикулярные элементы околососудистой ткани. Заболевание начинается с появления эритематозных или геморрагических пятен, узловатых уплотнений различной величины. Узелковые или бляшечные элементы сливаются, нередко в месте изъязвления наблюдаются кровоизлияния. Типичные места локализации - лодыжки, пальцы, тыльная поверхность стопы. Заболевание может появиться на любом участке кожи и слизистых оболочках полости рта, а также в области наружных половых органов. Часто наблюдается отек конечностей вплоть до слоновости. Саркома Капоши может сопровождаться висцеральными поражениями (лимфатические железы, желудочно-кишечный тракт, легкие, печень, сердце, кости). У больных появляются кашель, одышка, аритмия.
